[やあ]

久々に書き込みを頂いたので見落としていました。すみません。そして、キンタさん有難うございました。
じゃんさんも、有益な情報を有難うございました。

私は受精後の卵丘細胞は、なんの役にも立っていないと想像していたので興味深いお考えだと思いました。
探したら、内容をよくは読んでいませんが、卵丘細胞を胚移植と同時に注入すると着床率が上昇したという文献はありました。
Cumulus coculture and cumulus-aided embryo transfer increases pregnancy rates in patients undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2006;86(4):839–47.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16962106/
ご参考までに。

[やあ]

回収しやすい倍率もあると思うので、試行錯誤してみてください！

あと、ピペット先端で胚をつつけるくらいになってればOKと思います。

気になったことがあれば、またお気軽に書き込んでください。

[やあ]

こんにちは。

1wellとはどんなディッシュのことで、TSドロップ量はどのくらいご使用でしょうか？
また「回収に苦戦」とは、胚を見失ってしまうということですか？
それとも、浮遊している胚をピックアップするのが難しいということですか？

経験的には、トップ先端をTSに浸漬した直後に実体顕微鏡を覗いて素早くシートにピントを合わせれば、胚が外れるところが確認できるので、そのまま胚にピントを合わせて追っていけば見失うことはありません。

[やあ]

一般的と言えるかどうか、そこまで多くの施設を知ってる訳では無いので私は分かりません。

私の知ってるご施設では、採卵後に卵数を確認してから作製してます。

ただそれだと忙しい時は、予想して先に作ってしまうこともあるそうです。

[やあ]

こんにちは。

培養液ドロップにオイルを被せて直ぐに培養に使用するのであれば、オイルはあらかじめガス平衡が必要だと思います。
（オイルもガスが透過浸透しますので、ガス平衡されていないオイルを培養液ドロップに被せると、一時的に培養液内の炭酸ガスはオイルに吸収されてしまうと思っています。）

培養液ドロップにガス未平衡のオイルを被せてインキュベーターに入れた場合、約3時間で培養液のガス平衡が終了すると言われています。したがって、採卵当日の朝に培養用ディッシュを作製して3時間のガス平衡後に胚培養に使用している施設は多数あります。

ICSIやIVFでの受精後は、受精培養液を介さずに胚培養用培養液に入れて培養するのは、スタンダードな方法だと思います。

上記の様に考えますが、反対意見やご不明な点とかあれば、遠慮なく聞いてください。

[やあ]

メイロンのことは知りませんので、他の試薬が入っていないかだけ心配でしたが、調べると単純な炭酸水素ナトリウム液のようですので大丈夫ではないかと思います。

濃度計算もそれで合っていると思います。

[やあ]

じゃんさん、文献を有難うございました。私も全文は見られなかったので何とも言えませんが、射出精液中に円形精子細胞や精母細胞が存在するような趣旨の論文ですね。フローサイトメーターでは検出されたようです。ただ、どの位の頻度で入っていたかは抄録には記載が無いようなので、そこが気にはなります。少なくても、keikoさんのお写真の様に多量に円形精子細胞が精液に混入してくるとは、ちょっと考え難いです。

そういえば、先日お邪魔したクリニックで、精液中に精子が見つからなかった症例の洗浄沈渣も、同じように丸い細胞が多量に含まれていたのを思い出しました。共通した現象ですね。なんだろう？

[やあ]

こんにちは。
私は実際に臨床で円形精子細胞を扱っているわけではないので参考までに聞いてください。

お写真は、精巣組織ではなくて射出精液ですよね？
常識的に考えて、精液中にこれほど多くの円形精子細胞が出てくることはあり得ないと思います。
（勿論、FISH等により半数体細胞であるかどうかを判定しなくては、証明はできないと思いますが。）

では、お写真の円形細胞（っぽく見えるもの）は何なんでしょうね？
他の方のご意見も是非お聞きしたいです。
よろしくお願いします。

参考までに、下記リンクの文献にヒト円形精子細胞の特徴が詳しく書かれていました。
この文献から、円形精子細胞の直径は約7～8μmのようです。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4664346/pdf/pnas.201517466.pdf

[やあ]

実際にレーザーでAHAされているご施設の方のご意見をお聞かせ頂きたいですが、とりあえず臨床に携わっていない者の意見を書かせて頂きます。

①は、いつ収縮するか分かりませんので、ルーチン的には非現実的かと思います。

②は、実際にルーチン的におやりのご施設知っています。特に問題は起こっていないかと思います。

③については、以前は否定的でしたが、昨今のPGTのバイオプシーの手法で、TEにレーザーを照射して問題なさそうなのを見ていると、この方法が簡便でいいのかな？とも思ったりしています。

[やあ]

大腸菌ですか。

参考になりました。結果を教えて頂き有難うございました。

[やあ]

私も特に認識していなかったので少し調べてみました。
廃棄するヒトの胚を使わなければいけない検討なので、あまり報告が無いように思いましたが、
1つは下記の論文が参考になりそうでした。本文持っていませんが、要約に記載があります。
「ICM細胞数は5日目と6日目の間に倍増し（それぞれ20.4 +/- 4.0 と 41.9 +/- 5.0）」と記載あり。

抄録の機械翻訳貼り付けておきます。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2612378/

K Hardy, A H Handyside, R M Winston. The human blastocyst: cell number, death and allocation during late preimplantation development in vitro. Development, Nov;107(3), 597–604, 1989.

【アブストラクト】
正常受精と異常受精を含む181個の余剰ヒト胚の発育を、体外において2日目から5、6、7日目まで観察した。63/149（42％）の正常受精胚が5日目または6日目に胚盤胞期に到達した．全細胞数，対細胞外胚葉（TE）細胞数，内細胞塊（ICM）細胞数は，ポリヌクレオチド特異的蛍光色素による核の差次標識によって解析された。TE の核は、免疫外科的溶解中に 1 つの蛍光色素で標識した後、胚を固定し、2 番目の蛍光色素で両方の核を標識した (Handyside and Hunter, 1984, 1986)。5 日目に新たに膨張した正常受精胚盤胞は 58.3 +/- 8.1 個の細胞を有し，6 日目と 7 日目にはそれぞれ 84.4 +/- 5.7 個と 125.5 +/- 19 個に増加した．TE細胞数は、5日目と6日目には同程度であったが（それぞれ37.9 +/- 6.0 と 40.3 +/- 5.0）、7日目には倍増した（80.6 +/- 15.2）。一方、ICM細胞数は5日目と6日目の間に倍増し（それぞれ20.4 +/- 4.0 と 41.9 +/- 5.0）、7日目にはほとんど変化がなかった（45.6 +/- 10.2）。TEとICMの両方で、核の断片化によって証明されるような広範囲の細胞死があり、それは7日目までに大幅に増加した。これらの結果を，形態学的に異常な胚盤胞および異常受精胚に由来する胚盤胞の細胞数と比較した．また，停止した胚の核も調べた．正常受精胚盤胞に配分されたTEおよびICM細胞の数は、マウスに配分された数と同様であるように思われる。しかし、マウスとは異なり、両系統の細胞死にもかかわらず、ICM細胞の比率は高いままである。

[やあ]

細長い形状というと、過去に緑膿菌のコンタミはお聞きしたことはあります。

検査結果が出たら、また教えて下さい。

[やあ]

ICSI胚の培養液でコンタミとのことですが、もう少し詳しく教えて下さい。
コンタミしたのは、どのような形態のものでしたか？動いていましたか？（バクテリア？真菌？）
胚培養はドロップ個別培養ですか？ それとも集団培養ですか？
コンタミが起こったドロップ数はいくつでしたか？

過去に私がお聞きした事例もほとんどc-IVFだったと記憶していますが、ICSIでは絶対コンタミしないとは言えないとは思います。
ただ、真菌のコンタミは除くとして、バクテリアのコンタミは原因を正確には特定できないまでもその多くは精液からの混入だと思っています。
したがって、ICSIで高倍率で精子を選別している場合では、増殖するほどのバクテリアは混入しずらい様に想像しますが、実際はどうなんでしょうね？

[やあ]

私がやったのと同じ色になれば良いのでしたら、炭酸水素Na 1.26 w/v％と精製水を1：5で混ぜれば、0.21 w/v％になって、培養液と同等の炭酸水素Na濃度になるのではないかと思います。

0.04w/v%フェノールレッドの製品は使用したことないので分かりませんが、要は自分が確認できるだけの色が付けばOkなので、私が入れた量の10倍くらい入れれば良いのかもしれません。
そうすると、200µL/100ｍLくらい入れましたから、10倍だと2mL/100mLくらいですかね。
ただ、フェノールレッドが何の溶液で溶解されているか分からないので、その影響はあるかもしれませんので、とにかく一度お試しになってみて下さい。

まとめると、炭酸水素Na 1.26 w/v％ 10mL + 精製水 48.8ｍL ＋0.04w/v%フェノールレッド 1.2mL ＝ 合計60 mL

合ってますかね？

色が薄いようなら、フェノールレッドの量を増やして、その分精製水を減らしてください。

[やあ]

炭酸水素Na 25ｍM（0.105g/50mL）に市販 0.5％フェノールレッド溶液 100µL加えて、5％ CO2インキュベーターに入れて、約5時間後に写真撮影しました。

私は炭酸水素Naだけではダメだと思っていましたが、間違えでした。炭酸水素Naだけでフェノールレッドの色（pH）確認できますね。

左：大気中に放置
右：5％ CO2内 5時間平衡後

これは、一般的な培養液の色と同じくらいだと思います。
そちらで以前に使っていた市販品の色と比べてどんな感じですか？

（ちなみに、水にフェノールレッド溶液だけ添加したら、真っ黄色になってしまい、インキュベーターに入れても、もちろん黄色いままの溶液になってしまいました。）

[投稿者]

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