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初めて利用させていただきます
KITAZATOの融解液とCryotopを使用しているのですが、TS液に浸けた時点でtopから外れて液面に浮遊する胚の回収に苦戦しております
1well dishの中央にTS液を分注し、そこにtopを投入して150μmパスツールで回収する、という方法を行っているのですが、胚が浮いてしまった場合ピントを合わせてもなかなかスムーズに回収が出来ません
もし何かコツなどがあればご教授いただけると幸いです
あるいはKITAZATO社のプロトコルにあるように、35mm dishを導入すべきでしょうか？
ご指導の程宜しくお願いいたします
こんにちは。
1wellとはどんなディッシュのことで、TSドロップ量はどのくらいご使用でしょうか？
また「回収に苦戦」とは、胚を見失ってしまうということですか？
それとも、浮遊している胚をピックアップするのが難しいということですか？経験的には、トップ先端をTSに浸漬した直後に実体顕微鏡を覗いて素早くシートにピントを合わせれば、胚が外れるところが確認できるので、そのまま胚にピントを合わせて追っていけば見失うことはありません。
言葉足らずで申し訳ありません
Falconの60mmセンターウェルディッシュを使用してます
中央のウェルにTS液を約1ml弱分注し、そこにtopのシートを浸けるかたちです
苦戦しているのは浮遊している胚のピックアップです
倍率を上げてピントを合わせて回収を試みるのですが、1分以内というプレッシャーも相まってかパスツール内になかなか回収できません
他の方の技術指導文献等も参考にさせていただいたのですが、胚のピックアップについてはほとんど触れられておらず、触れるまでもない簡単なポイントなのか、そもそも何か自分の手技に問題でもあるのではないのかと思い、質問させていただいた次第です
ここまでで問題点等ございましたら、ご指導ご鞭撻宜しくお願いいたします
FalconのセンターウェルにTSを1mL入れる方法は、メーカーの推奨方法ではありませんが、多くの施設で実施されていて問題ない方法であると思います。
浮遊している胚を吸引するコツは、胚の高さとピペット先端の高さをぴったり合わせることです。
実体顕微鏡で胚にピントを合わせたら、同時にピペットの先端にもピントが合う様にピペットの高さを合わせます。
その状態で吸引をかければ、必ず胚はピペットに入ってくるはずです。
「そんなこと言ってもここが上手くいかないよ！」みたいなことがあれば教えて下さい。
融解方法自体は(推奨方法ではないが)特に問題ないとの事で安心いたしました
ご指摘いただいた、胚とピペットのピントがぴったり合っていれば回収されるとの事ですが、もしかしたら焦るあまりピントが微妙にずれていたのかもしれません…
ご指導いただいた事を参考に、ピント合わせを念頭に置いて改めて作業にあたって習熟度を上げていきたいと思います
それでも苦戦する際は、再びご指導をお願いできますとありがたいです…
やあ様、管理者様、この度はご指導誠にありがとうございました
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