融解時の胚の回収について

Home フォーラム 質問の部屋 融解時の胚の回収について

  • このトピックには6件の返信、3人の参加者があり、最後に長門により2ヶ月前に更新されました。
7件の投稿を表示中 - 1 - 7件目 (全7件中)
  • 投稿者
    投稿
  • #2718
    長門
    参加者

    初めて利用させていただきます

    KITAZATOの融解液とCryotopを使用しているのですが、TS液に浸けた時点でtopから外れて液面に浮遊する胚の回収に苦戦しております

    1well dishの中央にTS液を分注し、そこにtopを投入して150μmパスツールで回収する、という方法を行っているのですが、胚が浮いてしまった場合ピントを合わせてもなかなかスムーズに回収が出来ません

    もし何かコツなどがあればご教授いただけると幸いです

    あるいはKITAZATO社のプロトコルにあるように、35mm dishを導入すべきでしょうか?

    ご指導の程宜しくお願いいたします

    #2720
    やあ
    参加者

    こんにちは。

    1wellとはどんなディッシュのことで、TSドロップ量はどのくらいご使用でしょうか?
    また「回収に苦戦」とは、胚を見失ってしまうということですか?
    それとも、浮遊している胚をピックアップするのが難しいということですか?

    経験的には、トップ先端をTSに浸漬した直後に実体顕微鏡を覗いて素早くシートにピントを合わせれば、胚が外れるところが確認できるので、そのまま胚にピントを合わせて追っていけば見失うことはありません。

    #2723
    長門
    参加者

    言葉足らずで申し訳ありません

    Falconの60mmセンターウェルディッシュを使用してます

    中央のウェルにTS液を約1ml弱分注し、そこにtopのシートを浸けるかたちです

    苦戦しているのは浮遊している胚のピックアップです

    倍率を上げてピントを合わせて回収を試みるのですが、1分以内というプレッシャーも相まってかパスツール内になかなか回収できません

    他の方の技術指導文献等も参考にさせていただいたのですが、胚のピックアップについてはほとんど触れられておらず、触れるまでもない簡単なポイントなのか、そもそも何か自分の手技に問題でもあるのではないのかと思い、質問させていただいた次第です

    ここまでで問題点等ございましたら、ご指導ご鞭撻宜しくお願いいたします

    #2724
    管理者
    キーマスター

    FalconのセンターウェルにTSを1mL入れる方法は、メーカーの推奨方法ではありませんが、多くの施設で実施されていて問題ない方法であると思います。

    浮遊している胚を吸引するコツは、胚の高さとピペット先端の高さをぴったり合わせることです。

    実体顕微鏡で胚にピントを合わせたら、同時にピペットの先端にもピントが合う様にピペットの高さを合わせます。

    その状態で吸引をかければ、必ず胚はピペットに入ってくるはずです。

    「そんなこと言ってもここが上手くいかないよ!」みたいなことがあれば教えて下さい。

    #2725
    長門
    参加者

    融解方法自体は(推奨方法ではないが)特に問題ないとの事で安心いたしました

    ご指摘いただいた、胚とピペットのピントがぴったり合っていれば回収されるとの事ですが、もしかしたら焦るあまりピントが微妙にずれていたのかもしれません…

    ご指導いただいた事を参考に、ピント合わせを念頭に置いて改めて作業にあたって習熟度を上げていきたいと思います

    それでも苦戦する際は、再びご指導をお願いできますとありがたいです…

    やあ様、管理者様、この度はご指導誠にありがとうございました

    #2727
    やあ
    参加者

    回収しやすい倍率もあると思うので、試行錯誤してみてください!

    あと、ピペット先端で胚をつつけるくらいになってればOKと思います。

    気になったことがあれば、またお気軽に書き込んでください。

    #2730
    長門
    参加者

    倍率に関しては、上げれば回収しやすくなるだろうと思い込んで、とりあえず最大にしてしまっていました

    それからピペットで胚に触れる事ができる=ピントが揃ってるという点を見落としてしまっていました…

    いただいたアドバイスを参考に、ピペットで胚に触れるのに操作しやすい倍率を色々と探してみようと思います

    度重なるご指導、重ね重ねありがとうございます

7件の投稿を表示中 - 1 - 7件目 (全7件中)
  • このトピックに返信するにはログインが必要です。